YTHDF3促进带有m6A修饰的RNA的翻译和降解 | m6A专题

论文标题：YTHDF3 facilitates translation and decay of N6-methyladenosine-modifed RNA

刊登日期：2017年01月

发表杂志：Cell Research

影响因子：17.848

研究机构：芝加哥大学生物物理研究中心

摘要

N6-甲基腺苷（m6A）是真核信使RNA（mRNA）中含量最丰富的修饰，在细胞分化和组织发育中起着重要作用。它调节多个RNA生命过程：通过识别选择性结合蛋白，m6A 调节RNA生命周期包括RNA加工，翻译和降解。在细胞质中，m6A结合蛋白YTHDF1促进m6A修饰的mRNA的翻译，而YTHDF2促进m6A修饰的mRNA的降解。而另一个m6A结合蛋白YTHDF3，它的功能还不清楚。在本篇文章中，作者发现YTHDF3与YTHDF1一起作用，促进蛋白的合成；另一方面，YTHDF3又可通过YTHDF2促进mRNA的降解。敲除YTHDF1-3后细胞中带有m6A修饰的转录本数量急剧增加。这些结果表明，YTHDF3连同YTHDF1-2一起，加速了胞质中带有m6A修饰的mRNA的代谢。总的来说，这三个阅读蛋白协同作用，调控了细胞内RNA的生物学功能。

YTHDF3与YTHDF1和YTHDF2一起结合带m6A修饰的mRNA

作者首先用高效液相色谱法测定了YTHDF3结合的RNA的m6A水平，结果显示与对照组相比，YTHDF3结合的RNA具有显著高的m6A水平。接着，通过PAR-CLIP（光活性增强的核糖核苷交联和免疫共沉淀），发现YTHDF3结合的m6A位点主要位于终止子附近。M6A-seq结果显示结合位点是GGACU的motif。

作者还发现，PAR-CLIP和m6A-seq取交集后，有59%的峰值是重叠的。为了进一步确定此结果，作者通过RIP-seq和PAR-CLIP结果比对，发现它们有1239个转录本是一致的。另外，YTHDF3和另外两个阅读蛋白有许多相同的靶蛋白：与YTHDF1有58%相同的靶蛋白，与YTHDF2有60%相同的靶蛋白。

YTHDF3促进翻译

接着，针对YTHDF3是否促进翻译，进行翻译组测序，结果如上图所示，图A和B展示的是当YTHDF3敲低后，YTHDF3（A）和YTHDF1（B）的靶蛋白翻译效率显著降低，这提示，YTHDF3可调控翻译，而这与YTHDF1有关。

作者通过改造双荧光素报告基因质粒，将YTHDF1和YTHDF3嵌入质粒中，检测细胞翻译效率。结果显示，单独嵌入YTHDF1时显著提高了翻译效率；当同时嵌入YTHDF1和YTHDF3时，极显著的提高了翻译效率，这些结果充分表明了YTHDF3协同YTHDF1作用。

YTHDF蛋白在胞质中相互协助

那么，YTHDF3是如何促进翻译的呢？有两种可能：一是YTHDF3招募了翻译因子；二是YTHDF3协同YTHDF1发挥作用。

多聚体分析(polysome profiling)结果显示，YTHDF3主要在40S的组分中存在。而经典促翻译因子eIF3A和eIF3B在60S组分，这表明YTHDF3没有招募翻译因子，于是作者怀疑是YTHDF3协同了YTHDF1的功能。通过蛋白质谱，作者鉴定到，YTHDF3和YTHDF1具有86个共同蛋白（一共156个蛋白），这些结果指向着YTHDF3可能是和YTHDF1结合在一起，协同YTHDF1作用。

通过GST pulldown实验，观察到YTHDF3确实与YTHDF1结合在一起。不仅如此，YTHDF3还与YTHDF2也结合在一起。这个结果显示了YTHDF家族的各个成员彼此结合在一起，很有可能共同协同发挥作用。

进一步利用5′-32P标记RNA的方法，发现当YTHDF3敲低后，YTHDF1和YTHDF2结合的RNA量增多，且这个增多的量是和YTHDF3敲低的效率成正比的。

YTHDF3是否会影响YTHDF1-2对RNA结合的特异性呢？通过全基因组分析，作者观察到YTHDF1-2和YTHDF3具有大量相同的结合RNA。另外，当YTHDF3敲低后，YTHDF1-2的结合RNA数量都显著的下降了。这些结果揭示YTHDF3很有可能是影响了YTHDF1-2和RNA结合的特异性，而YTHDF1-2本身则决定了和RNA结合的能力。

测定YTHDF家族敲低后的HeLa细胞m6A水平，发现当YTHDF1-3敲低后，m6A整体水平显著升高。另一方面，通过标记RNA结合高效液相色谱的方法，作者发现YTHDF3和YTHDF1结合RNA的时间都显著早于YTHDF2。

因此，通过这篇文章，可总结出，m6A修饰的RNA是在YTHDF家族蛋白之间“流动”的：YTHDF3最先识别到m6A修饰的RNA，然后在YTHDF2识别并及降解它们前，将它们转给YTHDF1，促进翻译（如上图所示）。

小结

总体来说，这个工作首次揭示出了YTHDF家族另一蛋白YTHDF3的功能，补全了人们对于YTHDF家族功能的认识。YTHDF3通过与YTHDF1和YTHDF2共同作用来影响m6A修饰的mRNA的翻译和降解。YTHDF3可能会明显影响其他两个YTHDF的功能。因此，不同细胞类型或发育阶段的YTHDF蛋白可在时空上调控m6A修饰的mRNA的命运，进而调控生物学过程。

另外，还应注意的是，文章中的数据表明，敲低YTHDF3后还有一小部分蛋白的翻译却升高了，表明YTHDF3可能还有另外的机制，可抑制蛋白的翻译，这需要进一步的研究进行揭示。

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